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MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA
La microbiología es la ciencia que estudia los organismos microscópicos en todos sus aspectos entre los que se encuentran su distribución, características y efectos. En general se citan seis tipos de microorganismos: bacterias, hongos, virus, algas, protozoos y rickettsias. Entre todos estos grupos los que cobran más interés dentro de la microbiología alimentaria son las bacterias, los hongos y los virus por este orden. Nos vamos a centrar principalmente en el papel de las bacterias por ser el grupo más importante.
En la industria alimentaria se suelen realizar controles microbiológicos bien a los productos intermedios de la cadena productiva alimentaria o bien al producto final y se lleva a cabo bien en la propia empresa o, de lo contrario, se suele contratar un laboratorio externo que ofrezca el servicio. Es muy importante este campo dentro de la industria ya que el primer objetivo que debe buscar la empresa es la salubridad de sus productos quedando en un margen secundario, aunque muy importante a la vez dado el gran nivel de competencia existente en la actualidad, la calidad organoléptica y nutritiva del producto.
Los microorganismos son los seres vivos más ubicuos. Se encuentran tanto en el aire como en el suelo y agua en cantidades variables según el lugar. Las bacterias presentan una gran adaptabilidad al medio en el que se encuentran pudiendo resistir temperaturas, presiones o PH extremos. Esta gran adaptabilidad entraña un problema para la industria alimentaria.
Existen principalmente tres formas bacterianas; los cocos de forma esférica, los bacilos con forma de bastón y los espirilos que tienen forma de bastón curvado. El tamaño de las bacterias suele ser de unos 2 micrómetros de largo por algo menos de uno de ancho aunque varía según el género y la especie. Por ello, el microscopio óptico basta para observarlas mientras que en el caso de los virus que son unas diez veces más pequeños, es necesario el microscopio electrónico.
FACTORES QUE INFLUYEN EN EL CRECIMIENTO BACTERIANO
Los principales factores ambientales que influyen en el crecimiento bacteriano son los siguientes:
Las bacterias necesitan alimento tanto para utilizarlo como fuente de energía como para recambiar sus elementos del protoplasma y materiales estructurales. Según el tipo de bacteria de que se trate, las necesidades nutritivas son diferentes pero a groso modo el carbono, hidrógeno, oxígeno, nitrógeno, azufre y fósforo suelen ser indispensables y se suelen requerir cantidades menores de hierro, magnesio, potasio y calcio, y cantidades minúsculas de otros nutrientes.
La temperatura es uno de los factores de más importancia para la vida y crecimiento de los microorganismos. Unos tipos de microorganismos a una temperatura determinada experimentan su máximo crecimiento mientras que otros a esa misma temperatura se destruyen, no crecen o lo hacen a baja velocidad. Cada microorganismo tiene su temperatura mínima, óptima y máxima de crecimiento. En general la temperatura óptima de crecimiento, que es aquella a la que el microorganismo crece a más velocidad, suele ser bastante próxima a la temperatura máxima de crecimiento que es aquella temperatura más alta en la cual el microorganismo es capaz de crecer. Generalmente se suelen agrupar los microorganismos en diferentes grupos según las características de temperatura de cada uno de ellos.
GRUPO |
TEMPERATURA MÍNIMA (ºC) |
TEMPERATURA ÓPTIMA (ºC) |
TEMPERATURA MÁXIMA (ºC) |
Psicrófilo |
0-5 |
20-35 |
25-40 |
Mesófilo |
5-20 |
30-45 |
40-50 |
Termófilo |
35-45 |
45-70 |
60-80 |
La humedad ejerce también una gran influencia en el crecimiento del microorganismo. La idealidad del parámetro para el crecimiento de los microorganismos es más homogéneo, es decir, la humedad necesaria para el crecimiento de un microorganismo determinado es muy similar al de otros, al contrario que lo que ocurría con la temperatura.
En realidad, el término que más influye en el crecimiento de un microorganismo es la actividad de agua o agua disponible. Por ello, se suele utilizar en los alimentos la sal para disminuir el riesgo microbiológico de los mismos ya que disminuye sensiblemente la actividad de agua al estar compuesta por dos iones que ligan parte del agua existente en el medio. En general, las bacterias necesitan más agua que los hongos siendo imprescindible en todas las bacterias actividades de agua superiores a 0,93 aproximadamente. Las levaduras sin embargo son capaces de aguantar actividades de agua de 0,90 y los mohos incluso de 0,75. Existen algunos grupos de microorganismos como levaduras osmófilas, bacterias halófilas y mohos xerófilos que son capaces de aguantar actividades de agua menores el resto de sus homónimos.
La actividad de las bacterias depende del oxígeno. Las bacterias que necesitan de oxígeno para desarrollar su actividad se denominan aerobias estrictas. En el polo opuesto, están aquellas para las que la presencia de oxígeno es tóxica y se denominan anaerobias estrictas. Por ejemplo, el género Clostridium. Son pocos los géneros que se encuentran en ambos grupos, la mayoría toleran tanto la presencia como ausencia de oxígeno mostrando preferencia por las condiciones aeróbicas y se denominan aerobias facultativas. En ocasiones se suele incluir un cuarto grupo denominado microaerófilos que necesitan oxígeno pero en pequeñas cantidades, por ejemplo los Lactobacillus.
El PH es el logaritmo con cambio de signo de la concentración de iones hidrógeno. Este factor es decisivo en el crecimiento de los microorganismos. La mayoría muestran preferencia por PH entre 6,8-7,5. En cambio, las levaduras y mohos crecen bien a PH de 4 incluso inferior. En cualquier caso, existen excepciones como por ejemplo algunas especies del género Vibrio que crecen de forma óptima a PH de 8,5.
Determinadas sustancias químicas o biológicas bien naturales o adicionadas artificialmente al alimento tienen un efecto tóxico sobre los microorganismos. Por ejemplo, la lisozima y conalbúmina del huevo fresco, que están presentes de forma natural, son potentes inhibidores del crecimiento bacteriano. Otras sustancias son utilizadas como aditivos en los alimentos para conseguir una mayor seguridad microbiológica como por ejemplo los sorbatos en el pan para controlar el crecimiento de mohos.
CRECIMIENTO BACTERIANO
Si adicionamos los microorganismos a un medio en el cual se incluyen todos los nutrientes necesarios para su crecimiento (los alimentos lo suelen contener) y lo sometemos a condiciones favorables, éstos se multiplican por fisión binaria. Normalmente el crecimiento de los microorganismos en el medio suele seguir cuatro fases.
1.- Fase de latencia
Cuando los microorganismos son expuestos a un nuevo medio de crecimiento, éstos necesitan un periodo de adaptación cuya duración suele ser variable según el tipo de microorganismo. Normalmente suele rondan las dos horas y durante este tiempo no crecen y se dedican a aumentar su tamaño y a crear nuevos materiales.
2.- Fase logarítmica
Durante esta fase los microorganismos se multiplican y aumentan cuantitativamente de forma logarítmica. El tiempo de multiplicación es variable según el tipo de microorganismo, por ejemplo, el Escherichia coli es uno de los más rápidos y se multiplica cada 20 minutos aproximadamente en condiciones óptimas. De esta forma, a partir de una bacteria habrá dos a los veinte minutos, cuatro a los cuarenta minutos, ocho tras una hora, y siguiendo este crecimiento exponencial, tendremos 128 millones en nueve horas.
3.- Fase estacionaria
En este momento, el número de microorganismos en el medio se mantiene constante bien porqué el crecimiento ha cesado o porqué el crecimiento ha decrecido y es igual a la muerte bacteriana. Se produce como consecuencia de un empobrecimiento de nutrientes en el medio o bien por un enriquecimiento en los materiales de deshecho provocado por el metabolismo microbiano.
4.- Fase de declive
Es la última fase y el número de microorganismos decrece.
MICROORGANISMOS EN LOS ALIMENTOS
Los microorganismos (género o familia) que suelen plantear un mayor problema en la industria alimentaria por la frecuencia con que se encuentran en ellos en niveles intolerables son:
Salmonella
El genero salmonella comprende unos 2.000 serotipos distintos. Su temperatura óptima es de 38ºC, y son relativamente termosensibles. Las infecciones humanas y animales producidas por Salmonella se denominan salmonelosis. La principal fuente de intoxicación alimentaria por salmonelosis son las carnes, pero también son posibles fuentes de salmonella el huevo, la mayonesa y en general todos los ovoproductos, harina de carnes y huesos, leche sin pasteurizar y productos de pastelería. El periodo de incubación de la enfermedad es de 12-24 horas. Los principales síntoma de salmonelosis son nauseas, dolor abdominal, somnolencia, diarrea y fiebre. Si el microorganismo invade la sangre se puede producir una septicemia y en los casos más graves se puede llegar hasta el coma. La mortalidad de los afectados por salmonelosis suele ser menor al 1% siendo la población más vulnerable los ancianos, niños y enfermos.
Clostridium perfringens
Está clasificado como anaerobio estricto pero es capaz de crecer en presencia de un pequeño porcentaje de oxígeno. Su temperatura óptima de crecimiento es de 45ºC. Produce cinco tipos de toxina, la A, B, C, D y E. Los primeros síntomas de la toxiinfección aparecen transcurridas entre 6 y 22 horas y se caracteriza por dolores abdominales graves y diarrea. La recuperación suele ser rápida, entre 12 y 24 horas y la tasa de mortalidad es muy baja. Necesita ingerirse una cantidad muy grande de células viables para que se produzca la toxiinfección alimentaria. El Clostridium perfringens está ampliamente distribuido y se ha aislado de una gran variedad de alimentos predominando las carnes crudas de mamíferos y aves.
Clostridium botulinum
Produce la enfermedad del botulismo. Es un microorganismo esporulado y productor de neurotoxina. El botulismo de origen alimentario es la forma más grave de intoxicación alimentaria causada por la ingestión de alimentos que contienen la potente neurotoxina. Para destruirla, se debe calentar a temperatura de 80ºC durante al menos diez minutos. La incidencia de la enfermedad es baja pero es de interés público debido a la elevada tasa de mortalidad si no recibe diagnóstico a tiempo y es tratada apropiadamente. Los síntomas que produce son fatiga extrema, debilidad, vértigo seguido de problemas musculares como parálisis flácida y dificultad para hablar y engullir.
El periodo de incubación es de entre 12 y 36 horas pero puede prolongarse hasta los 8 días. La muerte ocurre por insuficiencia respiratoria y obstrucción de la entrada de aire por la tráquea. Los alimentos asociados son aquellos mal procesados o crudos que se conservar a temperatura y PH que permiten la multiplicación de la bacteria y el desarrollo de la toxina. Ejemplos: maíz en conserva, pimienta remolacha, espárragos, hongos, aceitunas, espinacas, pollo, paté, carnes frías, jamón, salchichas y marisco.
Escherichia coli
Es habitante habitual del intestino de todos los animales. La variedad de Escherichia coli o157:H7 produce colitis hemorrágica. Este microorganismo puede producir insuficiencia renal crónica. Los síntomas son vómitos, cólicos severos, y diarrea que puede incluir sangre. Alimentos asociados a la posibilidad de infección son las hamburguesas crudas, leche cruda, lechuga, jugo de manzana y todos alimentos que se han contaminado fecalmente.
Staphylococcus aureus
Es peligroso el Staphylococcus aureus enterotoxigénico. La presencia de la bacteria contamina los alimentos, principalmente en leche obtenida a partir de vacas con mastitis. Los síntomas son náuseas, vómitos, angustia, cólico abdominal y postración. Los alimentos asociados a la toxiinfección son carnes y derivados, aves, derivados del huevo, pastas, patata, leche cruda, productos lácteos y productos de pastelería. El S. aureus se encuentra en intestinos, piel, boca, garganta y heridas. Puede contaminarse al alimento a través de manos, nariz o boca. La prevención de la producción de toxinas se puede llevar a cabo a través de la refrigeración por lo que el uso de refrigeración y la buena higiene del manipulador de alimentos son las claves.
Bacillus cereus
Es un microorganismo esporulado Las fuentes de contaminación son la tierra, el polvo y heces. Los síntomas son diarrea acuosa, cólicos abdominales y náuseas. El periodo de incubación ronda las 8-16 horas. Los alimentos asociados son el arroz, patatas, pastas, queso, salsas, budines, sopas, productos de pastelería y ensaladas. Para evitar la formación de esporas, los alimentos deben mantenerse en refrigeración una vez han sido cocidos o ser ingeridos inmediatamente después de la cocción
Listeria monocytogenes
Es muy resistente ya que sobrevive a los tratamientos de congelación, desecación y calentamiento. Para destruirlo hay que someterlo a una adecuada cocción y pasteurización. No forma esporas. Los síntomas son fiebre persistente muy duradera, diarrea, dolor abdominal, vómitos, etc. Sus posibles secuelas son septicemia, meningitis, meningoencefalitis, y muerte del feto en embarazadas. Los alimentos asociados son leche cruda, quesos, helados, verduras crudas, salchichas fermentadas crudas, pollo, y carne y pescado crudos.
Campylobacter spp
Está presente en aguas no tratadas, sus síntomas son: diarrea, fiebre, dolor abdominal. náuseas, dolor de cabeza y dolor muscular. El periodo de incubación es de 2 a 5 días. Están asociados a alimentos como leche cruda, carne insuficientemente cocida y alimentos que han sufrido contaminación cruzada.
Las causas más importantes de enfermedades transmitidas por alimentos, y por tanto a evitar son:
ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS DE LOS ALIMENTOS
Los alimentos son analizados microbiologicamente en el laboratorio para verificar su seguridad microbiológica. Normalmente, a la hora de realizar los análisis microbiológicos de un alimento determinado, se suele seguir la legislación vigente y en caso de que haya un vacío legal, se suele seguir lo indicado en las normas ISO por ejemplo, sobre todo en el caso de que los alimentos vayan a ser exportados fuera de Europa.
Existen matrices de alimentos en los cuales se indican la dilución que hay que realizar del alimento para llevar a cabo el análisis microbiológico de un microorganismo determinado. Para la indicación de la dilución necesaria, se tiene en cuenta el parámetro establecido como límite de aceptable. Por ejemplo si en un determinado microorganismo el límite aceptable es de 100.000 ufc (unidades formadoras de colonia) / ml, se recomendará diluir la muestra cinco veces de manera que si en el resultado final no hay ninguna ufc, el producto será apto en ese parámetro por ser inferior al límite establecido y si hay 5 ufc por ejemplo, el producto será no apto porqué el resultado final al estar diluido cinco veces sería 500.000 ufc/ml. o g.
El operario de laboratorio deberá trabajar siempre con la bata de laboratorio y gorro que cubra todo el pelo. Además, no es recomendable hablar durante el trabajo por aumentar el riesgo de provocar una contaminación externa de la muestra. El operario debe lavarse las manos antes y después de su trabajar y ha de mantener perfectamente limpio su lugar de trabajo y evitar el riesgo de contaminaciones externas por operaciones inadecuadas como trabajar sin el mechero de laboratorio encendido, utilización de material no estéril, contacto de manos con el interior de la bolsa de stomacher que contiene el alimento, mantener permanente abierta la bolsa, etc.
A continuación, exponemos a modo de ejemplo la manera de determinar un parámetro microbiológico.
Investigación y recuento de microorganismos aerobios mesófilos
Los microorganismos aerobios mesófilos son la flora total compuesta por bacterias, hongos filamentosos y levaduras, aerobios estrictos o facultativos que presentan unas características térmicas intermedias. Con este análisis se refleja la calidad sanitaria e higiénica de la elaboración del alimento. Altos recuentos no son aconsejables salvo en el caso de los productos fermentados. Tasas de 106 ó 107 gérmenes/g indican descomposición del producto.
Para llevar a cabo el análisis microbiológico de los microorganismos aerobios totales, se utiliza un medio general para que puedan crecer todos los microorganismos que interesan. Existen medios generales como el PCA (Plate Count Agar), TSA (Triptosa Soja Agar) o AN (Aguar Nutritivo) en los que se encuentran todos los nutrientes necesarios para que crezcan la inmensa mayoría de los microorganismos. Otros medios son selectivos y diferenciales como el VRBG (Violeta rojo bilis glucosa) para la determinación del género Enterobacteriaceae. De esta forma, con la composición de ese medio, crece el género nombrado anteriormente pero no la gran mayoría de los demás ya que o no contiene todos los nutrientes necesarios para el resto o bien contiene algún elemento que les impide el crecimiento. Lo ideal sería que existieran medios que permitieran crecer únicamente al microorganismo cuya determinación se lleva a cabo, pero esto suele ser un ideal que no se suele alcanzar y las pruebas microbiológicas suelen ir acompañadas de confirmaciones bioquímicas para asegurar que la determinación se ha realizado sobre el microorganismo que interesa.
En este caso, el análisis se realiza con PCA y se suele llevar a cabo con una dilución del orden de 10-5 aunque es variable según el tipo de alimento. En primer lugar se toman 25 g. de una muestra representativa del producto total si es que éste es sólido, y se añade 225 ml. de agua peptonada en una bolsa estéril de Stomacher, y tras someterlo a homogenización, ya tenemos lista la dilución 10-1 de la muestra. A continuación, se realiza tantas diluciones como sean necesarias tomando 1 ml. de la dilución anterior y anadiéndola a un tubo de ensayo que contenga 9 ml. de suero fisiológica y así sucesivamente. Es muy importante que antes de que se tomen las muestras para verterlas bien en otro tubo de ensayo o bien en una placa de petri, se homogenice bien la muestra ya que los microorganismos tienden a concentrarse en la parte baja del habitáculo donde se encuentran por sedimentación. Se toman tantas pipetas estériles como diluciones sea preciso realizar
Una vez tenemos el tubo de ensayo con la muestra diluida, se toma con la pipeta estéril 1 ml. y se vierte en una placa de petri. L a siembra se puede hacer de dos maneras:
En el caso de la siembra en masa, se vierte el ml de muestra en la placa de petri y a continuación se vierten unos 15 ml de PCA líquido que está contenido en una botella que está en baño para que se mantenga a temperatura superior a su punto de fusión. A continuación, se homogeniza moviendo la placa de petri en el sentido de la agujas del reloj y al contrario, y en forma de cruz. Y a continuación se deja reposar hasta que se solidifique el agar por disminución de su temperatura a la del ambiente. Finalmente, se invierte la placa para que no se produzca condensación y se introduce en una estufa a 30ºC que es la temperatura óptima de crecimiento para lo que pretendemos determinar durante 72 horas. Pasado este tiempo, se saca la placa de la estufa y se hace un recuento de las colonias.
Cuando se ha vertido el ml. de muestra sobre la placa de petri, en ella están contenidos un número determinado de microorganismos que no son apreciables a la vista. Sin embargo, una vez que se les incubado a su temperatura óptima de crecimiento, pasado el tiempo se ha dado crecimiento bacteriano por lo que a partir de cada microorganismo individual se obtiene una colonia compuesta por millones de microorganismos que sí que se pueden contar a simple vista (las colonias). Por ello, cuando se dan los resultados de la muestra, se dice UNIDAD FORMADORA DE COLONIA ya que cada microorganismo ha formado una colonia.
En el caso de la siembra en superficie, primero se vierte el PCA en la placa de petri y se deja solidificar. Una vez ha solidificado el agar se vierte 1 ml. ó 0,1 ml de muestra y se extiende con un asa de drigalski por el agar hasta que éste lo absorbe y entonces es cuando la placa ya está lista para ser incubada.
Si transcurrido el tiempo de incubación, ha habido ausencia de crecimiento y la dilución empleada ha sido de 10-5 se expresaría el resultado como:
Aerobios mesófilos totales: < 1 x 105 ufc / g
Y es que no se puede afirmar que el alimento no tenga 9.999 ufc/g, dado que el análisis realizado ha sido sobre una dilución de cinco.
En el caso de que se hubieran contado 150 colonias el resultado sería:
Aerobios mesófilos totales: 1,5 x 107 ufc / g
En el caso de que el resultado sea mayor a 300 colonias, no se cuentan todas y se expresa:
Aerobios mesófilos totales: > 3,0 x 107 ufc / g
Otras determinaciones
La anterior exposición se ha efectuado a modo de ejemplo. Se pueden realizar multitud de análisis como por ejemplo Enterobacteriaceae con VRBG, o Staphylococcus aureus con medio Baird-Parker o Giolitti Cantoni para determinar su presencia o ausencia, MYPA para Bacillus cereus, SDA para mohos y levaduras, SPS para Clostridium sulfito reductores, etc. Para la confirmación bioquímica se suele utilizar en muchas ocasiones medios de cultivos generales y transcurridas 24 o 48 horas, se toman colonias aisladas a partir de las cuales, se hacen las pruebas como coagulasa, oxidasa, etc.